RNA pull down是體外條件下尋找目標RNA的結合蛋白的方法。使用體外轉錄法標記生物素RNA探針，將體外轉錄的RNA結合到Beads上，再將RNA-Beads和細胞裂解液孵育，這樣與目標RNA結合的蛋白便會一起吸附在Beads上。

洗滌掉不結合的蛋白后，用洗脫液將RNA-蛋白復合物從Beads洗脫下來，即RNA pull-down產物。該復合物可與鏈霉親和素標記的磁珠結合，從而與孵育液中的其他成分分離。

這種互作復合物既可以用Western Blot檢測特定的結合蛋白，還可以采用質譜方法鑒定與目標RNA結合的未知蛋白。

實驗大致流程：RNA探針制備→總蛋白提取→磁珠預處理→RNA PullDown（磁珠-RNA探針復合物富集互作的蛋白）→蛋白洗脫→WB檢測是否存在靶蛋白/質譜鑒定洗脫液中的蛋白

1 RNA探針制備

目前，體外RNA探針主要采用生物素標記，操作復雜且成本高。輝駿生物自主研發了一種用RNA標簽“F2”來標記目標RNA探針的方法（已申請專利，已有文獻引用），使標記更簡單，成本更低。以下詳細介紹下兩種標記方法。

1.1 生物素標記的RNA探針制備

（1）構建RNA過表達質粒：基因合成+測序驗證；

（2）體外轉錄模板準備：根據目標RNA序列設計帶有T7啟動子（TAATACGACTCACTATAGGG）的引物，以目標序列的DNA質粒為模板，PCR分別獲得T7-正義RNA（實驗組）和T7-反義RNA（對照組）轉錄模板，按照DNA凝膠回收試劑盒說明書要求回收純化目標DNA；

（3）體外轉錄：以上述DNA為模板，加入相應的RNA體外轉錄配置的反應體系（含生物素UTPs），37℃孵育2 h，再加入1 μL DNase I，37℃孵育15 min將DNA模板消化，得到正義和反義RNA；

（4）為了避免轉錄產物中的游離生物素UTP 競爭結合磁珠，此處最好采用 RNA 純化試劑盒來處理轉錄產物，但此操作可能造成一定的產物損失，可以根據具體情況決定是否進行此步操作；

（5）使用Nanodrop（紫外分光光度計）檢測RNA濃度，取1-2 μL RNA進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量和長度；符合要求的 RNA 置于- 80℃保存或直接用于后續實驗。

1.2 F2標記的RNA探針制備

（1）操作方法與生物素標記的RNA探針類似，但在制備DNA模板時，需要將17bp的F2序列一起加入到引物中。RNA體外轉錄體系則無需再加入生物素UTPs，節省了成本，后續也不需要進行RNA純化操作，簡化了操作步驟。

（2）以上述DNA為模板，加入相應的RNA體外轉錄配置的反應體系（無需再加生物素UTPs），37℃孵育2 h，再加入1 μL DNase I，37℃孵育15 min 將DNA模板消化，得到正義和反義RNA。

2??當目標序列過短（＜300bp）或過長（＞4kb）時，探針制備難度將增加；長序列可以分段進行實驗。

2 總蛋白提取

2.1 細胞樣本

（1）培養目標細胞，待細胞生長至合適密度，收集細胞；

（2）用預冷PBS緩沖液清洗細胞2-3次，加入0.6-1 mL預冷的裂解緩沖液（輝駿貨號：FI8101），在裂解液中預先加入6-10 μL蛋白酶抑制劑（輝駿貨號：FI8105）、3-5 μL RNA酶抑制劑（輝駿貨號：FI8106），現用現配；

（3）4℃混勻儀上裂解30 min或者冰上超聲至溶液基本澄清（如果無超聲條件，可置于冰上裂解30 min，期間每10 min渦旋混勻一次，每次5 s）；

（4）4℃離心機12000 rpm離心15 min，收集上清至新的1.5 mL無RNase EP管中；

（5）取30 μL作為input，剩余上清平分為兩份用于RNA pull-down實驗（記為實驗組和對照組），置于冰上備用或-80℃保存。

2.2 組織樣本

（1）采用預冷的PBS清洗新鮮組織，去除血液等成分；

（2）實驗組和對照組分別取0.2-0.4 g干凈的組織，用液氮在研缽中充分研磨，隨后轉移至預冷的無RNase、新的EP管中；

（3）將樣本置于冰上，加入0.6-1 mL預冷的裂解緩沖液，在裂解液中預先加入6-10 μL蛋白酶抑制劑、3-5 μL RNA酶抑制劑，吹打混勻，現用現配；

（4）4℃混勻儀上裂解30 min或者冰上超聲至溶液基本澄清；

（5）4℃離心機12000 rpm離心15 min，收集上清至新的1.5 mL無RNase EP管中；

（6）取30 μL作為input，剩余上清平分為兩份用于RNA pull-down實驗（記為實驗組和對照組），置于冰上備用或- 80℃保存。

3 磁珠預處理

(1) 將鏈霉親和素磁珠（輝駿貨號：FI8303）上下顛倒混勻，取實驗組和對照組一共所需的80 μL 磁珠到新的無RNase EP管中；

(2) 加入1 mL NT2緩沖液，顛倒混勻30次，放磁力架上靜置1 min 并棄上清；

(3) 重復上步操作一次；

(4) 加入400 μL NT2緩沖液，上下顛倒重懸磁珠；

(5) 將磁珠平分為兩份，每組各約200 μL，轉移到新的無 RNase EP管中，記為實驗組和對照組。

4 RNA pull-down

(1) 取實驗組和對照組RNA探針各3 μg，95℃加熱變性3 min，冰浴1 min，瞬離，向管中加入50 μL RNA結構緩沖液，室溫放置30 min；

(2) 將RNA探針分別加入對應的磁珠中，混勻儀上室溫孵育30 min；

(3) 放磁力架上靜置1 min，并棄上清；

(4) 每組加入500 μL漂洗液，顛倒混勻30次，放磁力架上靜置1 min，并棄上清；

(5) 重復上步操作一次；

(6) 加入相應組別的樣本裂解液，混勻儀上4℃孵育2~4 h；

(7) 放磁力架上靜置1 min 并棄上清；

(8) 每組加入 500 μL 漂洗液，顛倒混勻30次，放磁力架上靜置1 min 并棄上清；

(9) 重復上步漂洗操作兩次，共漂洗三次，保留磁珠。

5 蛋白洗脫

5.1 變性洗脫

（1）向磁珠中加入50 μL 1×SDS-PAGE上樣緩沖液進行洗脫，振蕩混勻后瞬離，95℃加熱5-10 min；

（2）放磁力架靜置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中，進行SDS-PAGE或Western Blot檢測，如果需要進行質譜檢測，則切膠條后送檢。

5.2 非變性洗脫 

（1）向磁珠中加入50 μL洗脫緩沖液（輝駿貨號為：FI8102），渦旋振蕩20 s，放混勻儀上室溫洗脫10-15 min，渦旋振蕩20 s；

（2）1000 g離心20 s，放磁力架上靜置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中；

（3）洗脫后的蛋白-80℃保存，或直接用于SDS-PAGE、Western Blot和質譜等實驗。

2??RNA pull-down捕獲的蛋白量通常較少，因此SDS-PAGE膠建議用硝酸銀染色，檢測富集蛋白的情況。

6 WB檢測是否存在靶蛋白/質譜鑒定洗脫液中的蛋白

6.1 WB檢測是否存在靶蛋白

通過蛋白印跡(Western Blot)技術使用Anti-Prey對沉淀中的蛋白質進行檢測，若能夠檢測在目標RNA沉淀中有清晰Prey條帶，則說明存在特異性相互作用。

6.2 質譜鑒定洗脫液中的蛋白

通過質譜鑒定實驗組與對照組的差異蛋白，進而篩選可能的互作蛋白。

Input組（陽性對照組）：樣本裂解液；

Antisense（對照組）：目標RNA反義鏈探針的pull-down產物；

Sense（實驗組）：目標RNA正義鏈探針的pull-down產物。

先看Input組：驗證Input組需檢測到待測蛋白（Prey）條帶。若Input組無信號，說明樣本中待測蛋白未提取成功或濃度過低，后續Sense組和 Antisense組的結果無意義，需重新優化蛋白提取步驟。

再比較Sense組與Antisense組：判斷特異性相互作用。若Sense組檢測到待測蛋白（Prey）條帶，且Antisense組無條帶或條帶極弱，說明目標RNA正義鏈能特異性結合待測蛋白，可判定二者存在相互作用。

RNA pulldown實驗驗證目標RNA與待測蛋白（Prey）是否存在相互作用，如果最終的結果Sense組有條帶，則可以證明之間存在相互關系。上圖為RNA pull-down陽性結果示意圖：表明目標RNA可以與Prey蛋白結合，存在相互作用。

?注意：

2??如果Sense組與Antisense組均未檢測到待測蛋白信號：需先確認Input組是否有信號，若Input組有信號則可能是探針與蛋白結合效率低（如探針標記失敗、孵育條件不當），需排查探針制備或孵育步驟。

1 RNA pull down試劑盒

2 RNA pull down實驗服務

如果您在做RNA pulldown實驗上還有疑問，歡迎咨詢我們的技術人員：400-699-1663。

輝駿生物還提供各種類型蛋白互作試劑盒以及互作實驗服務（IP、RIP、RNA pull down、ChIP、DNA pull down實驗），可根據實驗需求定進行選擇，助力您的科研更高效、更精準！