Jarrett D. et al:Multiplexed peptide analysis using data-independent acquisition and Skyline.
Nature protocols. 2015, IF=17.021
中文標題：基于數據獨立采集和Skyline的多肽分析
運用技術：DIA非標定量蛋白質組學
● 內容概述
本研究描述了在Q-Exactive質譜儀上使用數據獨立采集(DIA)在Skyline靶向蛋白質組學環境下檢測和定量復雜混合物中的多肽。DIA對MS/MS光譜的系統獲取與DDA相反，DDA獲取的MS/MS光譜只適用于鑒定一組隨機采樣的多肽。與選擇性反應監測(SRM)類似，可以使用有針對性的色譜提取從DIA數據中定量多肽。與SRM不同，數據采集不限于預先確定的一組目標肽。在該方案中，使用數據依賴采集(DDA)生成光譜庫，并從庫中所有肽的DIA數據中提取色譜圖。與SRM類似，DIA數據的定量是基于提取的MS/MS色譜圖曲線下的面積。此外，還詳細介紹了一種適用于DIA的基于目標MS/MS采集的質量控制方法。
● 方法流程
數據獨立獲取(DIA)是一種相對較新的基于質譜的技術，用于系統收集串聯質譜數據。DIA獲取的數據集被描述為樣本的“分子快照”，因為該數據可以查詢任何可檢測到的肽，既可以監測多肽的存在，也可以監測樣品中多肽豐度的變化。因此，DIA非常適合研究人員需要測量數百種(或更多)蛋白質的應用，或者研究人員希望在不需要獲取額外數據集的情況下靈活地研究多個假設的應用。本研究描述了如何使用DIA獲取和分析用于肽分析的質譜數據。與選擇性反應監測(SRM)或平行反應監測(PRM)等靶向采集方法相比，DIA的方法設置更簡單，后者需要復雜的程序來測量約50個以上的肽。
DIA幾乎只用于“自下而上”的質譜分析，即在分析之前使用蛋白水解酶(例如胰蛋白酶)將蛋白質消化成多肽。與完整蛋白質相比，合成的多肽降低了理化多樣性，簡化了樣品制備，提高了質譜靈敏度(圖1)。消化后，肽通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離，并通過電噴霧電離(ESI)接口直接發射到質譜儀。在捕集儀器(如Q-Exactive)上，傳輸到質譜儀的離子在短時間內被收集，并通過質譜(MS)或串聯質譜(MS/MS)進行分析。
沒有“一刀切”的DIA方法。設計最佳DIA方法的一些關鍵考慮因素是樣品復雜性、色譜條件、所使用的質譜儀以及所需的靈敏度。DIA方法的許多參數可能需要根據實驗進行調整。DIA方法的一些關鍵性能特征包括：MS/MS隔離寬度、色譜采樣率、M/Z覆蓋范圍、分辨率、質量精度、AGC目標和最大離子注入時間、樣品注射次數等。
實驗熱線：4006991663
