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中文標題：snoRNA相關lncRNA通過激活RNA編輯酶ADAR1促進白血病進展

發(fā)表期刊：Cell Discovery

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：38.079

發(fā)表時間：2022年11月

合作單位：中山大學生命科學學院

運用技術：LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定（由輝駿生物提供技術支持，點擊查看服務詳情）

● 研究概述

長鏈非編碼RNA (lncRNAs)與大多數(shù)典型的mRNA相似，通常是5 '帽子和3 'polyA結(jié)構。然而，這項新研究鑒定了一種新型的、與snoRNA相關的lncRNA，命名為LNC-SNO49AB，它包含兩個C/D盒snoRNA序列SNORD49A和SNORD49B，具有5 '帽子和3 'snoRNA結(jié)構。LNC-SNO49AB在白血病患者樣本中高表達，沉默LNC-SNO49AB能在體外和體內(nèi)顯著抑制白血病的進展。從機制上看，LNC-SNO49AB通過一種有別于snoRNA的作用方式在核仁中起作用，它可以直接結(jié)合ADAR1，促進其形成同源二聚體，使其具有更高的酶活性，進而促進全基因組RNA”A到I”編輯，最終促進白血病進展。

● 研究結(jié)果

1. 白血病中LNC-SNO49AB的特征

研究人員首先檢測了snoRNA相關的LNC-SNO49AB是否存在。SNORD49A和SNORD49B均位于17號染色體p11.2區(qū)域非編碼基因SNHG29的第二個內(nèi)含子上(圖1a)。Northern blot實驗證實，四種白血病細胞系中只存在一個成熟轉(zhuǎn)錄本(圖1b)。RACE和測序結(jié)果顯示該轉(zhuǎn)錄本包含SNHG29的第一外顯子和第二外顯子的5 '端至SNORD49A的3 '端，全長804 nt(圖1c) ，缺少polyA尾巴(圖1d)。RIP-qPCR實驗發(fā)現(xiàn)LNCSNO49AB可以被抗m7G抗體富集(圖1e)，這與真核生物snoRNA經(jīng)典的m3G或其他修飾不同。他們將這些lncRNA命名為“l(fā)nc-snoRNA”，其具有5 '端m7G和3 '端snoRNA結(jié)構(圖1f)。靶向LNC-SNO49AB中非snoRNA區(qū)域的siRNA不會改變SNORD49A或SNORD49B的表達(圖1g)，表明LNC-SNO49AB是一種穩(wěn)定的lncRNA，而不是snoRNA前體。生物信息學和多聚體分析表明，LNC-SNO49AB不具有編碼潛能(圖1h)。

圖1

2. LNC-SNO49AB加工需要完整的位點特異性snoRNA

SNORD49A和SNORD49B屬于C/D盒型snoRNA，包括其終端附近的C、D盒及遠處的D '、C '盒(圖2a)。通常，C/D盒型snoRNA的保守基序直接結(jié)合核心蛋白(snoRNPs)，如纖原蛋白(FBL)、NOP58、NOP56和15.5 K(圖2a)。那么這些核心蛋白是否與LNC-SNO49AB相互作用呢？RNA免疫沉淀(RIP)實驗顯示，LNC-SNO49AB可以被FBL抗體富集(圖2b)。RNA pull down實驗也證實LNCSNO49AB可以結(jié)合上述四個核心蛋白(圖2c-e)。當同時刪除SNORD49A和SNORD49B結(jié)構域時，LNC-SNO49AB不再與FBL相互作用(圖2f)。抑制FBL表達導致snoRNAs和lnc-snoRNA顯著下調(diào)(圖2g)，表明snoRNP復合物形成對LNC-SNO49AB的穩(wěn)定性至關重要。接著，依次刪除SNORD49B和SNORD49A的C、D、C′和D′框，發(fā)現(xiàn)只有SNORD49A的D盒影響LNC-SNO49AB形成 (圖2h)，表明只有末端的snoRNA對lnc-snoRNA的形成至關重要。因此，他們猜測在轉(zhuǎn)錄起始過程中，m7G先在LNC-SNO49AB 5 '端形成帽子結(jié)構，未剪接的第二內(nèi)含子序列保留在pre-LNC-SNO49AB中，當外切酶到達SNORD49A的snoRNP位置時，降解被阻止了，因此在3 '端產(chǎn)生了一個snoRNA(圖2i)。

圖2

3. LNC-SNO49AB在白血病中高表達，促進癌細胞增殖

通過對15例健康對照和94例白血病臨床樣本的分析顯示，LNC-SNO49AB在白血病中高表達 (圖3a)。在19個初步診斷完全緩解(CR)的樣本中， LNC-SNO49AB水平較低(圖3b)，表明LNC-SNO49AB水平與白血病的進展和治療結(jié)果相關。在多種白血病細胞中干擾LNCSNO49AB后，細胞增殖明顯降低(圖3c)，細胞周期阻滯(圖3d)，集落生成明顯受損(圖3g) ，其他靶點siRNA和寡核苷酸干擾的結(jié)果類似(圖3e)。LNC-SNO49AB過表達的效果相反。在白血病小鼠模型中(圖3j)，干擾LNC-SNO49AB導致異種移植腫瘤的脾臟大小和重量減少(圖3k)，RS4;11細胞在血液、骨髓、脾臟和肝臟中的浸潤也急劇減少(圖3i) ，且LNC-SNO49AB干擾小鼠有更好的生存結(jié)果(圖3m)。以上體外和體內(nèi)實驗結(jié)果均表明LNC-SNO49AB促進白血病發(fā)展。

圖3

4. LNC-SNO49AB在核仁中與ADAR1相互作用

LNC-SNO49AB在白血病中的作用機制是什么呢？CRISPR-Cas13系統(tǒng)的RNA成像(圖4a)和亞細胞組分分析(圖4b)結(jié)果顯示，LNC-SNO49AB主要位于細胞核，尤其是核仁。兩次獨立的RNA pull down結(jié)合質(zhì)譜（MS）分析實驗尋找了LNCSNO49AB的潛在結(jié)合蛋白。在質(zhì)譜鑒定到的蛋白質(zhì)中，一種位于核糖體中的RNA編輯酶ADAR1引起了注意。RNA pull down WB和RIP-qPCR實驗進一步驗證了ADAR1與LNC-SNO49AB的相互作用（圖4d）。此外，體外轉(zhuǎn)錄的LNC-SNO49AB可以與純化的Flag-ADAR1蛋白結(jié)合(圖4e)。免疫熒光顯示ADAR1與LNC-SNO49AB共定位于核仁中 (圖4f)。這些數(shù)據(jù)表明LNC-SNO49AB直接與ADAR1結(jié)合。

已知ADAR1包含3個主要結(jié)構與，對哺乳動物RNA”A到I”編輯至關重要。RNA pull down實驗表明ADAR1的dsRBD結(jié)構域的缺失強烈破壞了ADAR1與LNCSNO49AB的相互作用(圖4h); RIP分析顯示dsRBD對LNC-SNO49AB具有高親和力(圖4i)，并且截短的ADAR1片段有三個dsRBD有效地結(jié)合在LNC-SNO49AB上(圖4j, k)。在dsRBDs中，RI的缺失顯著降低了ADAR1與LNC-SNO49AB之間的相互作用，而RII和RIII結(jié)合LNCSNO49AB的效率較低(圖41,m)，表明ADAR1中dsRBDs的RI對LNC-SNO49AB的結(jié)合至關重要。RIII的缺失減少了ADAR1與已知RNA編輯底物的結(jié)合，但不太影響與LNC-SNO49AB的結(jié)合 (圖41)。

圖4

5. LNC-SNO49AB促進ADAR1二聚化

ADAR1的RNA編輯活性依賴于其同源二聚化(圖5a)。免疫共沉淀（Co-IP）結(jié)果顯示Flag-ADAR1與HA-ADAR1相互作用(圖5b)，刪除Flag-ADAR1的dsRBD損害了這種相互作用(圖5c)，表明dsRBD在二聚化中起關鍵作用。假設LNC-SNO49AB可能通過結(jié)合dsRBD影響ADAR1的二聚化，研究人員在293T細胞中同時過表達FLAG-ADAR1、HAADAR1和LNC-SNO49AB，HA-ADAR1的CoIP實驗顯示FLAG-ADAR1和LNC-SNO49AB均顯著富集(圖5d)。此外進行了兩步RIP實驗，第一步flag抗體和第二步HA抗體的RIP都同時捕獲了FLAG-ADAR1、HA-ADAR1和LNC-SNO49AB (圖5e)，表明LNC-SNO49AB和二聚體ADAR1形成了復合體。截短LNC-SNO49AB序列(圖5f)進行的RNA pull down實驗結(jié)果顯示，每個截短的LNC-SNO49AB片段都與ADAR1相互作用(圖5g)，表明LNC-SNO49AB序列中包含多個ADAR1結(jié)合位點。他們接著探索LNC-SNO49AB是否影響ADAR1的二聚化。Co-IP結(jié)果顯示，干擾LNC-SNO49AB降低了FLAG-ADAR1與HA-ADAR1的結(jié)合，過表達則增加了它們間的相互作用 (圖5h, i)，表明LNC-SNO49AB穩(wěn)定了ADAR1二聚化。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炑芯苛薒NC-SNO49AB是否影響ADAR149的活性(圖5j)。在hRLuc起始密碼子后插入一個終止密碼子，該序列可以被ADAR1識別，當進行”A到I”編輯時，終止密碼子UAG會變成UIG，使hRLuc恢復翻譯，結(jié)果顯示LNC-SNO49AB過表達比對照組產(chǎn)生了更多的hRluc(圖5k)。這些數(shù)據(jù)表明LNC-SNO49AB通過促進ADAR1的二聚化來提高ADAR1的活性。

圖5

6. LNC-SNO49AB的致癌作用部分取決于其對ADAR1活性的調(diào)節(jié)

為了確定LNC-SNO49AB是否通過促進ADAR1的RNA“A到I”編輯效率來發(fā)揮其致癌作用。作者在白血病細胞中干擾LNC-SNO49AB，轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示RNA “A到I”編輯整體下降 (圖6a,b)，并且si-ADAR1組384個失調(diào)基因中有162個也存在于si-LNC-SNO49AB組中(差異倍數(shù)> 2, FDR < 0.05)(圖6c)。GO富集分析表明差異基因主要參與細胞周期、Hippo信號傳導和脂蛋白代謝過程(圖6d)。敲低LNC-SNO49AB或ADAR1可顯著調(diào)節(jié)這些潛在靶基因的表達，進一步表明SNO49AB和ADAR1在有相似的調(diào)控作用(圖6e)。此外，在白血病細胞中干擾ADAR1會導致細胞周期阻滯(圖6f)和克隆生長受損(圖6g)，而ADAR1的過表達很大程度上挽救了LNC-SNO49AB敲低的效果(圖6h)。

圖6

● 結(jié)論：

LNC-SNO49AB通過增強ADAR1介導的RNA“A到I”編輯來促進白血病進展（圖7）。

圖7