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中文標題：人膀胱癌中的MIR516A通過降低PHLPP2表達和BECN1依賴性自噬發揮致癌作用

發表期刊：Autophagy

中科院分區：1區

影響因子：16.016

發表時間：2021年1月

合作單位：溫州醫科大學

運用技術：LC-MS/MS蛋白質譜鑒定（由輝駿生物提供技術支持，點擊查看詳情）

● 研究背景

根據以往報道，MIR516A在卵巢癌、肺癌、原發性胃癌和前列腺癌等多種癌癥中下調，并起到腫瘤抑制作用。但MIR516A和PHLPP2在人類膀胱癌（BC）中的表達情況和潛在作用仍有待研究。

● 研究結果

1. MIR516A促進體內和體外的BC細胞生長

qPCR檢測了MIR516A在新鮮臨床BC組織樣本和人BC細胞系（TCCSUP、UMUC3、J82和RT112）中的表達，發現MIR516A在BC樣本中的表達出乎意料的顯著高于對照（圖1A，B），這一結果與TCGA 數據庫中19對膀胱癌組織的檢測結果一致。體外建立的MIR516A干擾（MIR516Ai）穩轉株（BC細胞系：UMUC3和J82）和軟瓊脂實驗結果也表明抑制MIR516A可以顯著降低BC細胞的單層生長（圖1C-E），也會損害其錨定依賴性生長（圖1F，G）。

這些結果表明，MIR516A不僅在人BC組織中過表達，而且起致癌作用。在體內異種移植裸鼠模型中，注射MIR516A抑制劑減弱了裸鼠BC細胞的異種移植瘤生長（圖1H，I），表明MIR516A促進體內膀胱腫瘤生長。

圖1

2. MIR516A靶向PHLPP2并下調其在人BC細胞中的蛋白水平

TargetScan工具預測了MIR516A的可能靶基因ACTG2、ETS2和PHLPP2（圖2A），進而在干擾MIR516A的BC細胞中后檢測了三者的蛋白水平，發現PHLPP2上調（圖2B）。已知PHLPP2是一種良好的腫瘤抑制因子，因此選定其為研究目標。PHLPP2在BC細胞中的過表達顯著抑制了細胞的錨定非依賴性生長（圖2C，D）；雙熒光素酶實驗進一步確定了MIR516A對PHLPP2 mRNA 3’UTR的調控（圖2E，F）；qPCR實驗表明MIR516A不影響PHLPP2 mRNA水平（圖2G）（圖2G），預測MIR516A可能通過抑制其蛋白翻譯而下調PHLPP2。

那么， MIR516A是否通過PHLPP2影響BC細胞的錨定依賴性生長？在MIR516Ai細胞中繼續敲低PHLPP2，這增加了細胞的錨定非依賴性生長（圖2H，I），表明MIR516A誘導的PHLPP2下調在MIR516A促進BC細胞生長中起作用。

圖2

3. 抑制MIR516A可誘導BC細胞自噬并抑制錨定非依賴性生長

為了研究MIR516A對BC的調節機制，研究者在體外BC細胞（UMUC3和J82）中干擾MIR516A（MIR516Ai），自噬標記物LC3從LC3-I到LC3-II的轉變（圖3A）、LC3點狀聚集物（圖3B-D）和自溶酶體的形成（圖3E，F）表明MIR516A誘導了BC細胞自噬；而當MIR516Ai細胞繼續敲除PHLPP2后，這些自噬現象都受到抑制（圖3G-J）。

抑制MIR516A可誘導自噬，所以是自噬導致BC細胞生長抑制的嗎？研究者采用自噬抑制劑BAF處理MIR516Ai細胞，這導致LC3-II水平的顯著累積（圖3K），并逆轉了MIR516Ai對細胞錨定非依賴性生長的抑制（圖3L，M），表明MIR516A抑制人BC細胞中的自噬，進而促進BC細胞生長。

圖3

4. FBXW7-185aa對膠質瘤細胞的作用及其分子機制

MIR516A是否對自噬相關蛋白質(ATGs)的表達有影響呢？對MIR516Ai細胞中這些蛋白的檢測發現，只有BECN1（啟動自噬的關鍵蛋白）上調了（圖4A，B，再繼續敲低PHLPP2后，BECN1表達均減弱了（圖4C），表明BECN1被MIR516A抑制，并可能在MIR516A引起的自噬抑制通路中起作用。接著，他們在同時干擾MIR516A和PHLPP2的BC細胞中過表達BECN1，發現LC3-II轉化顯著增加（圖4D），細胞錨定非依賴性生長顯著被抑制（圖4E，F）。敲低MIR516Ai細胞中的內源性BECN1（圖4G）降低了LC3-II轉化、點狀聚集物形成和自溶酶體形成（圖4H-J），也挽救了MIR516Ai細胞的錨定非依賴性生長（圖4K，L）。這些結果表明，抑制MIR516A導致BECN1上調，進而誘導BC細胞自噬，且抑制其錨定非依賴性生長。

圖4

5. MIR516A-PHLPP2通路促進了cul4a介導的BECN1蛋白降解

在同時干擾MIR516A和PHLPP2的BC細胞中檢測BECN1 mRNA和蛋白水平，發現其mRNA沒有變化（圖5A），但是蛋白降解速率增加（圖5B-D）。此外，MIR516Ai顯著降低了BECN1蛋白的降解速率。之后，作者采用共免疫沉淀（co-IP）和質譜鑒定（LC-MS/MS）方法篩選了BECN1的互作蛋白，發現BECN1的互作蛋白中沒有PHLPP2，但卻包括E3泛素蛋白連接酶的幾個核心成分CUL3、CUL4A和CUL4B，并顯示出更高的肽譜匹配數（圖5E）。據報道，CUL3和CUL4可以通過泛素化介導的蛋白酶體調節BECN1蛋白的穩定性和降解。因此作者檢測了MIR516A和PHLPP2對這些蛋白表達的影響，發現只有CUL4A蛋白水平有變化（圖5F）。Co-IP實驗證實CUL4A和BECN1具有相互作用（圖5G）。CUL4A過表達和干擾實驗顯示，CUL4A促進BECN1蛋白降解。這些結果表明，MIR516A-PHLPP2依賴CUL4A促進BECN1蛋白降解。

圖5

6. 體內實驗表明MIR516Ai上調PHLPP2和BECN1，同時下調MKI6

體內異種移植瘤免疫組化（IHC）實驗顯示，MIR516Ai導致PHLPP2與BECN1表達上調、MKI67（癌細胞增殖標志物）陽性BC細胞持續減少（圖6A-D），并且PHLPP2表達與BECN1表達呈正相關（r=0.8235，p=0.0013）（圖6E）。

總之，這些結果表明，MIR516A抑制通過結合PHLPP2 mRNA的3′UTR上調PHLPP2，導致CUL4A介導的BECN1蛋白降解減少，并進一步增加BECN1介導的自噬，從而抑制BC生長（圖6F）。

圖6

● 研究結論

本研究發現MIR516A在人類膀胱癌（BC）中的作用與在已往報道的抑癌作用相反，它并非作為BC抑制因子，而是一種促進因子。MIR516A在BC組織和細胞系中顯著上調，抑制了其靶基因PHLPP2的表達，進而部分促進CUL4A介導的BECN1蛋白降解，減少了BC細胞自噬并促進BC生長。這是首次發現MIR516A在其他癌癥中未被發現的獨特功能。

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