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中文標題：P300/YY1/miR-500A-5p/HDAC2信號軸調節結直腸癌癌細胞增殖

發表期刊：Nature Communications

中科院分區：1區

影響因子：17.694

發表時間：2019年

合作單位：南方醫科大學

運用技術：LC-MS/MS蛋白質譜鑒定（由輝駿生物提供技術支持，點擊查看服務詳情）

● 研究背景

結直腸癌(CRC)是全球癌癥相關性死亡的主要原因之一，復發率和轉移率較高。闡明CRC發生和轉移的機制將有助于尋找新的診斷生物標志物和開發有效的治療干預措施。在過去的研究中已經發現了一些參與結直腸癌形成和發展的蛋白質編碼基因，然而，包括microRNA(MiRNA)在內的非編碼RNA的功能在很大程度上仍需進一步研究。

● 研究結果

1. miR-500a-5p在CRC中被下調

研究者通過陣列分析確定了人類正常結腸上皮FHC細胞和人類結腸癌細胞系SW620和LoVo中的總體miR表達。在這些差異表達的miR中，有十七個miR在SW620和LoVo細胞中共享相似的表達模式（圖1A）。其中，miR-500a-5p引起了研究者的注意。研究者檢測了miR-500a-5p在9個細胞系中以及81對人類CRC組織和匹配的非腫瘤組織中的表達水平。結果顯示，與正常人腸上皮FHC和NCM460細胞相比，SW480，DLD1，SW1116，SW620，HCT116，LoVo和Caco2細胞中的miR-500a-5p水平顯著降低。此外在64個CRC樣本中，miR-500a-5p的表達下調了7.67倍（圖1C）。與鄰近的正常結腸粘膜組織相比，其在CRC患者組織中的表達明顯降低（圖1D）。原位雜交（ISH）顯示它位于CRC細胞的細胞核和細胞質中（圖1E）。此外，研究者將患者按照低表達/高表達分組 ，Kaplan–Meier生存曲線分析結果表明，miR-500a-5p表達低的442例結腸癌患者的總體生存期較短。這些發現表明，在CRC細胞中miR-500a5p的表達下調，且miR-500a-5p的低表達與CRC患者的不良生存率有關。

圖1

2. miR-500a-5p的表達減弱了CRC的惡性進展

為確定miR500a-5p表達的臨床相關性，研究者首先評估了CRC的臨床病理特征，結果顯示miR-500a5p的低表達與CRC的惡性進展有關。為探討miR-500A-5P在CRC發展中的作用，研究者分別用miR-500a-5p模擬物和miR500a-5p抑制劑轉染極低水平miR500a-5p的CRC細胞和正常人的結腸上皮細胞。克隆形成實驗和EDU實驗結果表明，miR-500A-5p在CRC細胞中的表達增加，導致細胞增殖受到抑制（圖1F-I）。FACS分析、傷口愈合和跨孔侵襲實驗也進一步表明，miR-500A-5P對CRC細胞的惡性特性有抑制作用。

圖2

3. HDAC2是miR-500A-5P的一個功能性靶標

生物信息學分析結果顯示，在微陣列和生物信息學數據之間有66個基因重疊(圖2A)。其中，含有HDAC2基因的60個基因在miR-500A-5P過表達細胞中與對照細胞相比顯著下調(圖2B)。研究者通過WB和miRNA分析研究了潛在靶基因HDAC2與miR-500A-5p表達之間的相關性，結果顯示與相應的非癌對照組相比，癌組織的HDAC2蛋白表達水平較高，而miR-500A-5p的表達水平較低(圖2C，D)。此外，81例患者的CRC標本中HDAC2的mRNA水平與miR500a-5p的表達水平呈負相關(圖2E)。熒光素酶報告分析實驗結果表明，miR-500A-5p與miR-500A-5p模擬物共轉染HDAC2-WT3?-UTR后，熒光素酶活性降低。這兩個位點中的任何一個突變都取消了miR-500A-5P對熒光素酶活性的抑制作用(圖3A，B)，進一步證實了HDAC2是miR500a-5p的靶基因。WB分析轉染miR-500A-5p模擬物或抑制劑的結腸上皮細胞中HDAC2蛋白的表達，結果表明，與m-NC細胞相比，該蛋白在轉染miR-500a-5p模擬物的CRC細胞中表達下調，而在正常人結腸上皮細胞FHC和NCM460中表達上調(圖3C)。克隆形成、WST-1和Transwell實驗表明，HDAC2的過表達可以部分消除miR-500a-5p對細胞的抑制作用(圖3D-F)。這些結果表明，miR-500A-5p通過下調HDAC2的表達來抑制CRC的發生和發展。

圖3

4. miR-500A-5P通過靶向HDAC2在體內抑制CRC細胞的生長

為了評價miR-500A-5p對裸鼠體內腫瘤生長的影響，研究者進行了小鼠異種移植模型實驗(圖4A)。結果顯示，注射LoVo/miR-500A-5p細胞的小鼠的腫瘤比注射LoVo/m-NC細胞的小。此外，注射LoVo/HDAC2細胞的小鼠比注射LoVo/Vector和LoVo/miR-500A-5p細胞的小鼠形成了更大的腫瘤，而LoVo/miR-500A-5p/HDAC2細胞形成的異種移植瘤比LoVo/HDAC2細胞小(圖4A，B)。接下來，研究者檢測了五組移植瘤中細胞增殖(Ki-67)和血管生成(CD105)標志物的蛋白表達。IHC染色分析結果顯示，與LoVo/m-NC組相比，LoVo/miR-500A-5p組的增殖率和腫瘤血管密度顯著降低(圖4C-F）。此外，LoVo/HDAC2組與LoVo/Vector組和LoVo/miR-500a5p細胞組相比生長迅速，腫瘤血管密度增加，而LoVo/miR-500A-5p/HDAC2組抑制了LoVo/HDAC2組的生長速度和腫瘤血管密度(圖4D，F)，而LoVo/miR-500A-5p/HDAC2組的生長速度和腫瘤血管密度均低于LoVo/Vector組和LoVo/miR-500a5p細胞組(圖4D，F)。這些數據證實了miR-500A-5P下調了HDAC2介導的小鼠CRC細胞的生長。

圖4

5. MIR-500A-5P受轉錄因子YY1負調控

研究者分析了miR-500A-5P基因上游1kb的基因組DNA序列。本實驗表明，miR-500A-5p啟動子(p-Luc-1kb)能夠驅動熒光素酶的表達。因此，miR-500A-5P的表達是由其自身的啟動子驅動的。一些研究表明轉錄因子YY1與HDAC相互作用，因此研究者研究了轉錄因子YY1是否能調節CRC細胞中miR-500A-5p的表達。CONSITE軟件分析結果顯示，YY1的三個最可能的結合基序位于?327至?333、?622至?628和?741至?747區域(圖5A，B)。雙熒光素酶試驗表明，YY1細胞中miR-500A-5p位點1、2和3的活性比載體細胞降低2.5倍以上(圖5C)。為了證實YY1在體內能夠與miR-500A-5P啟動子物理結合，研究者在表達外源YY1的CRC細胞中進行了ChIP-qPCR檢測。用抗YY1抗體進行免疫沉淀后，3個YY1結合位點的miR-500A-5p啟動子區域均有明顯的富集(圖5D)。

研究者進一步分析了YY1和miR-500A-5p在10例新鮮收集的CRC活檢組織中的表達情況。結果顯示與相應的非癌對照相比，癌癥組織顯示出更高的YY1蛋白表達，而miR-500A-5p的表達則降低(圖5E)。YY1mRNA表達與miR-500A-5p表達呈負相關(圖5F)。此外，YY1的瞬時表達不僅導致了miR-500A-5p的成熟形式，也導致了miR-500A-5p的前體或初級轉錄本在LoVo和SW620細胞中的表達減少(圖5G)。研究者還評估了HDAC2或YY1的表達與相同臨床病理參數之間的關系。結果表明，HDAC2和YY1的表達與CRC分化程度、淋巴結轉移和TNM分期顯著相關。最后，采用免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)方法檢測基因表達。結果顯示，miR-500A-5p在CRC組織中的表達明顯低于癌旁正常組織，免疫組化顯示CRC組織中HDAC2和YY1的表達明顯高于癌旁正常組織。miR-500A-5p的表達與HDAC2或YY1呈負相關（圖5H）。這些結果表明，YY1下調了CRC細胞miR500a-5p的表達水平，從而影響了YY1-miR500a-5p-HDAC2通路的功能。 

圖5

6. 在CRC細胞中，miR-500A-5p表達的恢復是通過YY1/p300/HDAC2復合體上調的

研究者將HA標記的p300轉染到CRC細胞中，檢測p300蛋白是否與HDAC2或YY1相互作用。結果表明，抗HA(P300)抗體可以從細胞提取物中共沉淀HDAC2和YY1(圖6A)。同樣，HA(P300)或YY1用抗HDAC2抗體進行免疫共沉淀(圖6B)。為進一步證實HDAC2-p300-YY1復合體的形成，研究者使用內源蛋白進行了免疫共沉淀實驗。抗p300抗體可以從CRC細胞提取物中共沉淀HDAC2和YY1(圖6C)。類似地，p300和YY1都被抗HDAC2抗體(圖6D)免疫共沉淀，這表明這三種蛋白很可能在體內以復合物的形式存在。為了探討miR-500A-5P分子與YY1/p300/HDAC2復合體的關系，分別將載體YY1、HDAC2和p300的表達質粒與YY1+p300、HDAC2+p300和YY1+HDAC2+p300聯合轉染CRC細胞，結果表明，p300過表達促進miR-500a5p的表達，而YY1或HDAC2則抑制miR-500a5p的表達。此外，p300與HDAC2和/或YY1協同作用可抑制CRC細胞miR-500A-5p的表達(圖6E)，表明YY1或HDAC2與p300有拮抗作用，從而抑制miR-500A-5p的表達。

接下來，研究者將YY1、HDAC2和p300表達質粒分別單獨或與YY1+p300、HDAC2+p300和YY1+HDAC2+p300共轉染到報告基因質粒pGL3-miR-500A-5p上，結果表明YY1和HDAC2單獨表達對miR-500A-5p有明顯的抑制作用，而p300的異位表達則刺激miR-500a-5p的表達。當HDAC2+p300、YY1+p300或HDAC2+p300+YY1共轉染時，發現與p300共轉染可減緩對HDAC2或/和YY1的miR-500a5p轉錄活性的降低(圖6F)。ChIP實驗證明了YY1與miR-500A-5p啟動子區域的結合與LoVo和SW620細胞中三個YY1結合位點的HDAC2和p300相關。過表達/敲除實驗表明，YY1的過表達增加了YY1與miR-500A-5P位點1、2和3近端啟動子的結合。此外，在CRC細胞中，p300的瞬時轉染減少，而HDAC2的過表達增加，YY1與miR-500A-5p啟動子的結合(圖6G)。相反，YY1基因敲除降低了YY1與miR-500A-5p啟動子的結合。這些結果表明，在CRC細胞中miR-500a5p的過表達是通過YY1/p300/HDAC2復合體上調的。

圖6

7. 治療性傳遞miR-500A-5P能夠抑制異種移植瘤和FK228治療的CRC腫瘤發展

細胞凋亡實驗結果顯示，miR-500A-5P比對照組更能誘導LoVo細胞凋亡。為探討miR-500A-5p在細胞對HDAC抑制劑FK228介導的細胞凋亡敏感性中的作用，研究者用FK228處理細胞，流式細胞分析顯示，轉染miR-500A-5p+FK228的細胞凋亡率明顯高于miR-500A-5p(圖7A)。這些結果表明miR-500A-5P在體外可促進腫瘤細胞的凋亡，并增強腫瘤細胞對FK228誘導的凋亡誘因的敏感性。為了探討miR-500A-5P對CRC的治療潛力，研究者建立了異種移植小鼠模型和FK228處理的CRC模型。結果顯示，注射LoVo細胞39天后，miR-500A-5P和miR-500A-5P+FK228組小鼠的腫瘤體積明顯小于MNC組（圖7C，D）。TUNEL染色顯示，聯合注射miR-500A-5P和FK228的腫瘤細胞凋亡率最高(圖7E)。這些發現提示miR500a-5p增強了癌細胞對HDAC抑制劑FK228誘導的凋亡觸發器的敏感性。以上結果表明，miR-500A-5P具有腫瘤抑制作用，具有治療CRC的潛力。

圖7

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